聚合酶链式反应（PCR）快速检测腐烂苹果中的扩展青霉 下载 pdf 百度网盘 epub 免费 2025 电子版 mobi 在线

内容包括：苹果汁中的扩展青霉污染及PCR技术应用、扩展青霉基因组DNA的提取、腐烂苹果中的真菌分离与鉴定、基于氯化苄法提取DNA的PCR检测扩展青霉方法优化、PCR扩增产物的克隆测序、扩展青霉3.3703基因组DNA快速提取、PCR特异性扩增扩展青霉3.3703和扩展青霉3.5425、扩展青霉3.5425实时 PCR快速检测条件优化、PCR快速检测不同来源扩展青霉菌的条件优化。

章 苹果汁中的扩展青霉污染及PCR技术应用

节 我国苹果及其加工生产状况

一、苹果特性及其营养价值

二、我国苹果的生产现状与发展前景

三、我国苹果加工面临的竞争与挑战

第二节 棒曲霉毒素

一、理化性质与危害

二、分析方法

第三节 扩展青霉

一、概述

二、检测方法

第四节 PCR技术应用概述

一、PCR技术原理

二、PCR检测技术的发展

三、PCR技术在微生物检测领域的应用

第五节 真菌DNA提取

第六节 克隆测序

一、感受态细胞的制备

二、蓝白筛选的原理

三、电泳的原理

第七节 本研究的目的意义、内容及技术路线

一、研究目的及意义

二、研究内容

三、研究的技术路线

第二章 扩展青霉基因组DNA的提取

节 材料与方法

一、试验菌株与培养基

二、主要试剂

三、主要仪器

四、菌体培养与收集

五、DNA提取方法

六、DNA检测方法

七、PCR扩增方法

八、凝胶电泳检测方法

第二节 结果与分析

一、培养方式的选择

二、五种提取扩展青霉基因组DNA方法的比较

三、五种提取方法所提DNA结果的比较

四、电泳检测所提DNA的结果

五、PCR扩增结果

第三节 结论与讨论

第三章 腐烂苹果中的真菌分离与鉴定

节 材料与方法

一、材料与试剂

二、仪器与设备

三、方法与步骤

第二节 结果与分析

一、棒曲霉素产生菌的主要种类

二、不同产地腐烂苹果中棒曲霉素产生菌的差异

第三节 结论与讨论

第四章 基于氯化苄法提取DNA的PCR检测扩展青霉方法优化

节 材料与仪器

一、主要原材料

二、主要试剂

三、主要仪器设备

第二节 方法与步骤

一、引物选择

二、退火温度的优化

三、引物浓度的选择

四、模板浓度的选择

第三节 结果与分析

一、引物的选择

二、退火温度

三、引物浓度优化结果

四、模板浓度

五、特异性

六、灵敏性检测结果

第四节 结论与讨论

第五章 PCR扩增产物的克隆测序

节 材料与仪器

一、主要试剂

二、主要仪器设备

第二节 方法与步骤

一、感受态细胞的制备

二、PCR扩增产物回收纯化

三、克隆质粒的构建

四、转化感受态细胞

五、质粒DNA制备

六、质粒的双酶切鉴定

七、测序

第三节 结果与分析

一、转化结果

二、阳性克隆鉴定结果

三、测序与Blast结果

第四节 结论与讨论

第六章 扩展青霉3.3703基因组DNA快速提取

节 材料与方法

一、材料与试剂

二、仪器与设备

三、方法与步骤

四、提取DNA的纯度及浓度检测

五、PCR扩增

六、凝胶电泳检测

第二节 结果与分析

一、四种方法提取DNA纯度及浓度检测结果

二、四种方法提取总DNA样品检测结果

三、PCR扩增检测结果

第三节 结论与讨论

第七章 PCR特异性扩增扩展青霉3.3703和扩展青霉3.5425

节 材料与方法

一、材料与试剂

二、仪器与设备

三、方法与步骤

第二节 结果与分析

一、PCR扩增引物筛选结果

二、PCR引物特异性试验结果

三、PCR敏感性试验结果

第三节 结论与讨论

第八章 扩展青霉3.5425实时PCR快速检测条件优化

节 材料与方法

一、材料与试剂

二、仪器与设备

三、方法与步骤

第二节 结果与分析

一、退火温度对扩展青霉3.5425实时PCR结果的影响

二、引物浓度对扩展青霉3.5425实时PCR检测的影响

三、实时 PCR灵敏度检验

第三节 结论与讨论

第九章 PCR快速检测不同来源扩展青霉菌的条件优化

节 材料与方法

一、材料与试剂

二、主要仪器与设备

三、试验方法与步骤

四、试验真菌培养基

第二节 结果与分析

一、PCR退火温度优化结果

二、适引物浓度的筛选

三、适模板浓度的筛选

四、适底物浓度的选择

五、优化参数条件下的PCR检测

六、人工感染六品的PCR检测

第三节 结论与讨论

参考文献

何鸿举，爱尔兰都柏林大学（University College Dublin）博士，河南科技学院特聘教授、硕士生导师、食品无损检测与分析团队带头人，主要从事食品质量分析与快速检测研究。近五年主持或参与科研项目13项，发表论文30余篇，以作者发表高水平SCI论文10篇，主编教材2部，并担任食品科技领域20余种SCI期刊审稿人。

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第

1

章 苹果汁中的扩展青霉污染及

PCR

技术研究现状

我国是苹果及苹果汁生产的大国（李军等

2004

），是其制品生产和贸易的主要国家之一，其中浓缩苹果汁的出口量已占到世界贸易量的

60%

（王田利

2009

），但是由于我国苹果汁产业采用的原料往往是生长期或者收获期的残次落果，原料的新鲜度、健康度、成熟度都无法进行很好地控制，对于农药残留的状况与美国和欧盟等一些发达国家相比，仍存在一定的差距（杨振铎

2009

）。此外，由于贮藏与加工能力的不足，导致了大量的苹果出现腐烂现象。通常，在加工生产的过程中，我国的苹果浓缩汁生产企业，常会遇到果汁的色值、风味、耐热菌、浑浊度、农药残留、棒曲霉素等主要的质量问题（王素梅和杨文领

2003

）。当前，我国的苹果除了鲜销以外，苹果浓缩汁是其深加工的主导产品。在出口过程中，其中的棒曲霉素含量是一项要求非常严格的指标，它含量的多少直接影响着出口量与价格，因此，有效地控制苹果浓缩汁中棒曲霉素的含量是保证我国苹果浓缩汁加工业持续发展的当务之急（王素梅和杨文领

2003

）。

近些年来，随着相关的科学技术不断发展，苹果汁生成的一些问题已经找到了有效的解决方法，但如棒曲霉素含量超标等问题，仍然是影响我国苹果浓缩汁出口和产业发展的主要难题之一，该问题的存在极大地制约了整个苹果汁行业的发展。

棒曲霉素是一种能引起动物致畸、致突变和致癌的真菌毒素，它的存在引起了世界各国卫生、医学、毒理学、食品安全等方面学者与专家的极大关注，特别值得一提的是苹果汁的主要消费群体是青少年，长期摄入棒曲霉素超标的果汁会对他们造成极大地危害。为了建立人类对棒曲霉素的安全指南，

JECFA

近将其日可食入量从

1

μ

g/kg

体重

/d

降为

0.4

μ

g/kg

体重

/d

，另外，

JECFA

还规定水果及加工产品中棒曲霉素的含量应小于

25

μ

g/kg

。国际上建议在人类食用的苹果产品中棒曲霉素的残留量应该低于

50

μ

g/kg

，而许多国家则将果汁中棒曲霉素的残留量调整在

20 ~ 50

μ

g/kg

之间。

随着国际社会上对在苹果浓缩汁中棒曲霉毒素的限量的不断降低，苹果浓缩汁中棒曲霉毒素的残留问题已成为各果汁生产厂商为棘手的问题之一，并越

?

越受到关注。围绕着降低浓缩苹果汁中棒曲霉毒素残留含量的问题，科技工作者做了大量的研究工作（陈启民等

2001

；李君文和晃福寰

1997

；叶怀庄和吴丽丽

1996

），但是并未从根本上解决棒曲霉毒素对苹果汁的污染。现有的办法主要是在加工后进行吸附脱除，但是吸附脱除不仅增加工作量，也对果汁中的其他营养成分造成了一定的影响，同时，该操作方法只是将棒曲霉毒素转移到了清洗用水等苹果汁加工过程的下脚料中，并未得到分解和实质性的降低，还会对环境造成潜在危害的（张小平等

2004

）。

要从根本上解决浓缩苹果汁加工中的棒曲霉毒素残留问题，对棒曲霉毒素产生菌进行控制，必须从源头来控制棒曲霉毒素产生菌的生长，从而抑制毒素形成。要解决这一问题，判断苹果原料是否受到棒曲霉毒素产生菌（主要为扩展青霉）的污染是问题的关键所在，特别是在早期如何检测棒曲霉毒素产生菌尤为重要，而传统的检验检测扩展青霉的方法主要是培养法，并采用形态学方法进行鉴定，不仅耗时较长，而且常常对进出口商品造成经济损失，目前，

PCR

技术是一种快速有效的检测扩展青霉污染的方法，在检测棒曲霉毒素产生菌方面有其独到之处。

PCR

技术已广泛应用于生物检测的各个方面，得到了比较广泛的应用，本研究基于

PCR

技术快速检测的优点，旨在研究

PCR

技术检测法在苹果及苹果汁中棒曲霉毒素产生菌—扩展青霉的快速检测方面的应用，为

PCR

技术真正实现快速检测奠定基础，为进一步早期控制和降低棒曲霉毒素的污染提供理论依据和方法支持，终提高苹果及苹果汁制品的安全质量。

1.1

我国苹果及其加工生产状况概述

1.1.1

苹果特性及其营养价值

1.1.1.1

生物学特性

苹果，学名

Malus spp

，是蔷薇科（

Rosaceae

）苹果属（

Malus

）植物的果实。苹果树为多年生落叶乔木，原产于欧洲、中亚和我国新疆西部一带，栽培历史已有

5000

年之久，是温带地区的主要水果树种类之一（綦菁华

2003

）。

苹果具有自己独特的性质：苹果的果实形状一般呈现长圆形或者扁圆形，并且苹果的品种不同，其果实的形状、尺寸大小也不同；绝大多数品种苹果的果肉质地酥脆、汁液丰富，果肉常呈现乳黄色，白色；苹果的种子呈卵圆形等（孙爱东

2002

）。

1.1.1.2

营养组分

大量的科学研究及报道已证明，苹果含有大量的营养组分，主要包括：糖、脂、蛋白质、纤维素等一些大分子物质；

VB1

、

VB2

、

VC

等维生素；部分矿物质元素，如磷、锌等；还有部分有机酸，如尼克酸、酒石酸、鞣酸等（李宝江等

1995

；苏青峰

2005

；许高升

1991

）。

1.1.1.3

保健作用

苹果因其具有丰富的营养成分，而使得其保健作用更加广泛：（

1

）苹果中的糖主要以还原糖为主，而且含量很高，容易被人体所吸收，可作为开发低糖食品的良好原材料；（

2

）苹果中的营养组分可有效预防高血压、动脉硬化、冠心病等心脑血管疾病的发生：苹果酸与胆酸结合，可起到降低胆固醇的作用；

VC

和纤维素也有类似的功效（楚明和杜玉虎

2004

；李延斌

2002

；露民

2003

；姚玉新

2002

）；（

3

）苹果中的某些成分可有效降低呼吸系统疾病的发生率：比如改善肺和呼吸系统功能，可达到降低呼吸系统疾病发生的作用。常吃苹果，有助于气喘病和肺癌发病率的降低，吸烟者肺气肿的发病率也会显著降低（李延斌

2002

）；（

4

）苹果具有一定的抗癌功能：苹果中的黄酮类化合物与多酚化合物相结合后，生成物可抑制癌细胞的生长，从而起到抗癌作用（阿英

2003

；楚明和杜玉虎

2004

；姚玉新

2002

）；（

5

）苹果可预防糖尿病：苹果中的可溶性纤维素可通过调节机体的血搪水平，预防糖尿病的发生（阿英

2003

；楚明和杜玉虎

2004

；顾海剑

2002

；露民

2003

）；（

6

）苹果可起到排毒作用：这主要是苹果中的果胶在起作用，以防止中毒（露民

2003

）；（

7

）苹果中的一些营养组分可促进儿童的生长发育和记忆力的增强，例如维生素和一些矿物质等（李延斌

2002

）；（

8

）苹果还具有防止腹泻、阻止肥胖等医疗保健作用（露民

2003

）等。

…………………………

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书摘插图

前言

扩展青霉菌（

Penicillum expansum

）是引起苹果腐烂的主要真菌之一，是一种多细胞丝状真菌，也是棒曲霉素的主要产生菌。棒曲霉素是一种致畸、致癌真菌毒素，国际上对食品中，尤其是果汁中的棒曲霉素含量有明确的规定。要控制棒曲霉素的产生量，应该从根本上控制扩展青霉的生长，直接的方法就是对其进行准确快速检测并及时采取有效措施进行控制。传统的检测扩展青霉菌的方法主要是培养法，结合形态学的鉴定，耗时长且受主观因素影响，不能达到快速检测的目的，这就要求我们寻找一种新的检测方法。近些年来，随着聚合酶链式反应（

Polymerase Chain Reaction

，

PCR

）技术在微生物检测方面的发展和应用，其快速准确的优势发挥明显。因此，研究如何利用

PCR

技术快速检测棒曲霉素产生菌——扩展青霉，并设法在工艺过程中对其进行控制，减少棒曲霉素产生菌，对提高苹果汁质量与安全具有重大意义。

PCR

技术应用检测的基础是基因组

DNA

的有效提取。首先以加拿大国家食品安全研究所提供的扩展青霉菌菌株为试验原材料，通过比较

5

种常规的真菌

DNA

提取方法，获得适合提取该扩展青霉菌基因组

DNA

的方法，并设计适合于该菌的特异性引物，优化

PCR

扩增反应条件，获得一组

PCR

扩增扩展青霉菌

DNA

参数，后进行克隆测序。主要获得以下结果：

 …………………………………………

为了进一步验证

PCR

技术快速扩增检测扩展青霉菌的适用性，继续以中国普通微生物菌种保藏管理中心提供的扩展青霉菌

3.3703

和分离自腐烂苹果中的各真菌为试验原材料，采用液体培养法比较筛选真菌

DNA

提取方法，并根据扩展青霉菌的聚半乳糖醛酸酶

polygalacturonase

基因内一段保守序列设计特异性

PCR

扩增引物，优化

PCR

扩增条件，获得一套适扩增该扩展青霉

DNA

的优化参数，试验的主要结果如下：

 …………………………………………

本书介绍的研究结果为前期控制苹果中扩展青霉菌的产生、防止棒曲霉素的污染提供了有效的理论指导，可用于商业苹果感染扩展青霉菌的检测，也可作为使用此技术检测其他微生物的方法学参考。

本书所涉大部分试验是在西北农林科技大学樊明涛教授的指导下完成的。在试验过程中得到了西北农林科技大学食品科学与工程学院的硕士生袁晖、李瑜、李亚菲、李亚辉、刘晓娇和吕丽娟等的大力帮助，在此表示衷心感谢。同时，衷心感谢博士生王树林、贺江、刘柳、王毕妮、焦凌霞、冉军舰等在试验过程中给予的指导与建议。

由于编写时间仓促、资料有限，以及在试验操作过程中可能存在误差，书中难免存在不妥之处，敬请读者谅解，并提出宝贵意见。